作用于球形细胞，可通过求解细胞电动力学方程确定细胞内部的电场分布[26-27]为摘要 传统的细胞电融合技术通常采用持续时间为微秒级的短时高压电脉冲诱导细胞电穿孔来实现。然而，高幅值微秒脉冲在促进细胞电融合的同时易导致细胞过度穿孔而死亡，从而限制了细胞的融合效率。为进一步提高细胞电融合率，该文基于纳秒脉冲电场所诱导的“超穿孔现象”，结合常规的微秒脉冲电融合技术，提出纳/微秒复合脉冲协同诱导细胞电融合的方法。以SP2/0小鼠骨髓瘤细胞为实验对象，利用COMSOL软件分析复合脉冲作用下细胞膜上跨膜电压与穿孔密度的分布，并进行初步的电融合实验，探究该融合方法对细胞融合率和死亡率的影响。仿真结果显示，传统微秒脉冲作用下，细胞膜的两极与接触区域的跨膜电压均超过穿孔阈值，显著穿孔面积超过10%。而等剂量的纳/微秒复合脉冲作用下，跨膜电压仅在细胞接触区域达到较高值，电穿孔也集中于该区域。实验结果同样证明，该方法能够保证较低细胞死亡率（10%）的同时达到较高的细胞融合效率（75%）。该研究为细胞电融合技术的进一步发展提供了新的思路。
关键词：细胞电融合 纳/微秒复合脉冲 融合效率 跨膜电压 穿孔密度
细胞融合作为细胞工程的一项核心技术，在生产生活中发挥着越来越重要的作用[1]。采用人工干预的细胞融合为某些疾病提供了全新的治疗方式，如糖尿病[2]、中枢神经系统轴突再生[3]、自身免疫疾病[4]以及恶性肿瘤[5]等疾病均可通过细胞融合产物得到有效治疗。根据所采用干预方式的不同，细胞融合技术可分为化学融合法[6]（聚乙二醇）、生物融合法[7]（仙台病毒、日本血凝病毒）和物理融合法[8]（离心、振动、电融合）等。其中，细胞电融合作为物理融合方法的一种，相较化学融合法、生物融合法以及其他物理因子所诱导的细胞融合方法，具有可重复性高、操作简便、对细胞无毒、便于实时观察等突出优势，已经逐渐发展成为最有效、最具前景的细胞融合技术之一[1]。
事实上，细胞电融合技术是由人们所熟知的微秒脉冲电场（microsecond Pulsed Electric Fields, msPEF）诱导细胞电穿孔现象发展而来。维尔兹堡大学的U. Zimmermann[8]利用msPEF进行电穿孔实验时，发现经过脉冲处理的部分细胞发生了融合，由此便创立了一种全新的细胞融合方法——电融合法。基于msPEF的细胞电融合技术一经提出便得到了国内外学者的广泛关注和持续研究，日本学者M. Senda等[9]利用msPEF成功实现了植物原生质体的电融合，并迅速将该技术推广到动物、微生物的原生质体融合中，推动了电融合技术的跨越式发展；南开大学汪和睦团队[10-11]实现了鼠源B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的电融合，并在此基础上制备了多种不同抗性的杂交瘤细胞株；卢布雅尔纳大学的D. Miklavcic等[12]采用电场强度1.2kV/cm、脉宽100ms、频率1Hz的8个脉冲分别单独处理B16-F1细胞和CHO细胞，发现两种细胞都能够进行融合，但融合效率有所差别；瓦伦西亚理工大学的J. Cardona- Costa等[13]采用不同电场强度、脉宽的msPEF处理太平洋牡蛎受精卵，探讨受精卵融合效率与微秒脉冲参数的依赖关系；上海瑞金医院李雁等[14]研究发现，200V、25ms的直流脉冲是人体细胞核移植的最佳电融合参数，融合率达到53.6%。除了上述理论研究成果之外，基于msPEF的细胞电融合在设备研制方面也取得了积极的进展。重庆大学Hu Ning等[15]为提高融合效率，研制出高通量细胞电融合芯片；东京大学K. Sugahara等[16]开发了有利于大细胞高效配对的动态微阵列电融合设备。
尽管基于msPEF的电融合技术已经取得了长足的进展，但是在融合过程中仍存在较高的细胞死亡率，极大地限制了融合效率的进一步提升。为此，M. Kanduser等[17]提出通过添加脂质抗氧化剂对细胞进行保护以有效降低细胞死亡率；Qu Pengxiang等[18]则尝试通过添加褪黑素来达到降低死亡率的效果。然而，化学试剂的添加无疑会导致步骤的增加、生产工序的繁杂以及经济成本的提高。M.Kanduser等[19]研究发现，融合细胞的死亡率之所以居高不下，其关键在于msPEF施加过程中导致细胞膜上出现大面积穿孔。因此，欲从根本上提升细胞电融合效率，应在保证产生满足电融合需求的穿孔的同时，尽可能地避免细胞膜过度穿孔情况的出现。
近年来，脉宽相对更窄的纳秒脉冲电场（nano- second Pulsed Electric Fields, nsPEF）以其独特的“细胞内电处理”效应在生物医学领域得到了越来越多的关注[20-21]。同时，也有大量的仿真和实验研究证实，nsPEF同样可以作用在细胞外膜，并使其产生大量纳米级尺寸的微孔，即所谓的“超穿孔”（supra- electroporation）现象。Hu Qingfang等[22]基于分子动力学仿真发现，电场强度100kV/cm、脉宽10ns的nsPEF能在细胞外膜上快速产生纳米级微孔；L. M. Mir等[23]采用电场强度40kV/cm、脉宽10ns的单个nsPEF处理DC-3F细胞，发现nsPEF同样可以使细胞膜穿孔，但穿孔尺寸较小，常用的大分子染色剂并不能通过细胞膜进入细胞内部；G. Saulis 等[24]也同样证实nsPEF作用下细胞膜上产生孔洞数量远大于msPEF，但尺寸较小，恢复时间较短，不易造成细胞死亡。
鉴于此，本文尝试将nsPEF引入细胞电融合，使其首先在细胞膜上产生尺寸相对较小的微孔，继而再施加低幅值msPEF对孔洞进行维持和扩张，以避免直接施加高幅值msPEF造成细胞膜大面积穿孔，从而降低死亡率，最终达到提高细胞融合效率的目的。为此，本文选择小鼠骨髓瘤细胞SP2/0为研究对象，建立融合细胞动态电穿孔模型，对比分析msPEF及纳/微秒复合脉冲作用下，细胞膜的跨膜电压（Transmembrane Voltage, TMV）分布及穿孔变化情况，并初步开展细胞融合实验，利用荧光显微镜观察染色细胞的融合情况，探究纳/微秒复合脉冲提高细胞电融合效率的可行性。
在COMSOL Multiphysics中建立相互接触的双细胞模型，采用有限元方法，对脉冲作用下细胞跨膜电压的分布及细胞膜穿孔情况进行仿真分析。
1.1.1 双细胞几何模型
由于细胞融合实验是在低渗融合缓冲液中进 行[25]，待融合细胞会略微膨胀接近球体，因此，本文将细胞简化为标准球体[19]。标准球体具有空间轴对称性，可以建立二维几何模型来减少计算量，以缩短仿真时间。细胞融合仿真模型示意图如图1所示，用一个长200mm、宽200mm的空间来模拟细胞融合时的外环境，两侧的条状矩形用于模拟铜制极板，其中，左侧极板施加高电位，右侧极板接地。细胞的物理尺寸按SP2/0骨髓瘤细胞的实际尺寸进行设置，其中，细胞半径为5.6mm，细胞核半径为4.723mm，细胞核质比约为70%。令两细胞相互接触并沿电场方向排列，接触区域垂直于电场，长度设置为2mm。将细胞各部分简化为各向同性的线性均匀介质，分别用电导率和介电常数表示细胞模型各部分的电特性，各区域边界设置为电绝缘，计算时用三角形进行剖分，并对需要重点求解的细胞膜部分进行二次细化，剖分单元为12 368个域单元（999个边界元）。
1.1.2 动态电穿孔模型
对左侧极板施加脉冲电压U，则会有脉冲电场作用于球形细胞，可通过求解细胞电动力学方程确定细胞内部的电场分布[26-27]为
图1 细胞融合仿真模型示意图
Fig.1 Schematic diagram of cell fusion simulation model
（1）
式中，s 为给定位置（包括胞内介质、胞外介质和膜）的电导率；Y 为细胞膜、核膜上任意一点的电位；e0为真空介电常数；er为相对介电常数；t为时间；
为空间梯度算子。细胞膜的内外电位差为
（2）
式中，DY 为跨膜电压；Yi为膜的内电位；Yo为膜的外电位。
在外加电场的作用下，细胞内外离子运动并聚集在膜两侧，细胞膜和核膜的穿孔可以描述为磷脂双分子层受电位变化影响形成大量亲水微孔。穿孔的形成为跨膜电流提供新的通道，大量的穿孔将显著提高膜的导电性。此时，整体的跨膜电流密度可以表示[26-27]为
（3）
式中，J为电流密度；sm0为膜的初始电导率；em为细胞外溶液介电常数；dm为细胞膜厚度；Jep为跨膜电流密度增量，其计算公式由K. A. De Bruin和W. Krassowska提出[28]，有
（4）
（5）
（6）
其中
式中，iep为流过单个微孔的电流；N为孔密度；sp为孔隙电导率；r为微孔半径；w0为孔隙阻碍能量系数；n为孔隙相对密度；F为法拉第常数；R为气体常数；T为热力学温度。孔密度N呈动态变化，可通过Smoluchowsky方程[28]求解，有
（7）
式中，N0为初始孔密度；Vep为电穿孔特征电压；q为穿孔有效形成率系数；a 为穿孔系数。Vep决定了细胞膜的穿孔阈值VT，文献[27]给出了二者之间的关系，生物质膜的VT通常取值为500～1 000mV，本文选取VT=1 000mV（Vep=258mV）[19, 29]。
将式（5）～式（7）代入式（4），可得到电流增量为
（8）
膜电导率sm与孔密度呈正相关，膜动态电导率由初始电导率及穿孔后的电导率增量相加得到[30-31]，有
（9）
电场作用下穿孔半径的变化情况[30-31]为
（10）
式中，D为孔半径扩散系数；k为玻耳兹曼常数；b为空间排斥能；g 为边缘能量；rh和rt为平流速度常数；Fmax为TMV=1V时的最大电动力；r*为亲水孔最小半径；deff为膜有效张力系数，可求得deff为
（11）
式中，d0和
分别为无孔膜的张力及烃-水界面的单位面积能量；S为细胞的表面积。本文脉冲施加过程中，细胞形状及表面积的变化并不显著，因此将deff作为常数处理。
仿真研究中细胞所有几何参数和电气参数的取值及其来源见表1。
表1 仿真模型几何参数与电气参数
Tab.1 The geometric and electrical parameters used in the simulation
物理量数值来源 细胞半径rc/mm5.6[32] 细胞核半径rn/mm4.723[33] 细胞外溶液电导率se/(S/m)0.01[19] 细胞膜初始电导率sm0/(S/m)5×10-7[19] 细胞膜介电常数emem4.5[19] 细胞质电导率sc/(S/m)0.25[19] 细胞质介电常数ec70[19] 核质电导率sn/(S/m)0.5[33-34] 核质介电常数enp70[19] 核膜电导率sne/(S/m)1×10-4[33-34] 孔隙电导率sp0.22[31] 细胞外溶液介电常数em80[31] 核膜介电常数ene7[31] 初始孔密度N0/m-21.5×109[28] 细胞膜厚度dmem/nm5[28] 核膜厚度dne/nm10[28] 电穿孔特征电压Vep/V0.258[28] 微孔半径r/nm0.8[28] 穿孔系数a/(m-2s-1)1×109[28] 穿孔有效形成率系数q2.46[28] 孔隙阻碍能量系数w02.65[26] 孔隙相对密度n0.15[26] 最小亲水孔半径r*/nm0.51[27] 孔半径扩散系数D/(m-2s-1)5×10-14[27] 空间排斥能b/J1.4×10-19[27] 边缘能量g/(J/m)1.8×10-11[27] 平流速度常数rh/nm0.97[27] 平流速度常数rt/nm0.31[27] TMV=1V时最大电动力Fmax/(N/V2)7×10-8[27] 膜有效张力系数seff1×10-6[31]
1.1.3 复合脉冲电穿孔效应仿真
利用COMSOL软件中的AC-DC模块和PDE模块对两个接触细胞在脉冲作用下的电穿孔情况进行瞬态仿真。为了准确地对比单msPEF和纳/微秒复合脉冲的作用效果，本文采用等剂量的脉冲施加方式，脉冲剂量[32, 35]为
（12）
式中，Vx 为第x个脉冲的幅值；Tx为第x个脉冲的脉宽；X为脉冲个数。
脉冲波形示意图如图2所示。参考细胞融合仪（ECM2001，美国BTX Corporation）参数推荐，选用电场强度2.21kV/cm，脉宽40ms的单个msPEF作为对照组的脉冲施加方案（见图2a）。鉴于单个nsPEF对细胞膜作用有限[19]，本文经过初步实验探究，选取5个电场强度6kV/cm，脉宽200ns的nsPEF，结合一个电场强度2kV/cm，脉宽40ms的msPEF作为复合脉冲的组合方式（见图2b）。nsPEF的施加间隔为1ms，两种脉冲转换间隔设置为5ms。对整个模型区域进行有限元仿真计算，由于双细胞模型的对称性，为避免重复，在进行细胞膜分析时仅对部分膜区域进行展示，具体区域如图3加粗部分所示。
图2 脉冲波形示意图
Fig.2 Schematic diagram of pulse waveform
图3 仿真分析区域示意图
Fig.3 Schematic diagram of the analysis area
本文通过开展细胞电融合实验，进一步从实验的角度验证纳/微秒复合脉冲作用细胞电融合的可行性。为更好地对比纳/微秒复合脉冲及msPEF的作用效果，采用三种不同的脉冲剂量分别进行实验并统计细胞融合效率和死亡率，所涉及的实验方法和材料如下。
1.2.1 融合缓冲液配置
低渗融合缓冲液通常用于脉冲处理细胞的实验过程，该缓冲液（90mOsm/L）包含Mg2+（0.1mmol/L）、Ca2+（0.1mmol/L）、牛血清蛋白（1mg/mL）以及D-甘露醇（所有试剂均购自美国Sigma Corporation）。等渗融合缓冲液含120mmol/L D-甘露醇，该缓冲液仅用于洗涤细胞。用电导率仪测试两种缓冲液的电导率，电导率均为0.01S/m。
1.2.2 细胞处理
实验所用的小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）购自上海雅洁生物科技有限公司，培养在37℃、5% CO2加湿的环境中，含10%胎牛血清的RPMI1640培养基上。在脉冲处理前，先将清洗、消化、润洗后的细胞通过血细胞计数板进行计数，并配制成细胞密度为1×106/mL的细胞悬液。将0.5mL的细胞悬液和0.5mL的Hoechst 33342（10mg/mL，美国Solarbio Corporation）加入培养皿中充分混合，并置于培养箱中培养20min充分染色。染色完成后使用5mL磷酸缓冲盐溶液（Phosphate Buffered Saline, PBS）洗涤两次，以去除剩余染料。再用5mL等渗融合缓冲液洗涤一至两次，即可将细胞置于500mL低渗融合缓冲液中，进行脉冲处理。
1.2.3 细胞电融合实验验证
取Hoechst染色完成的细胞接种于平行电极（45-0105，美国BTX Corporation）进行细胞融合实验，该电极由带有矩形极板的玻璃微载玻片制成，电极间距为3.2mm，体积为650mL。细胞电融合实验平台为课题组自行设计，如图4所示。数字信号发生器和功率放大器用于生成正弦波形，并输入脉冲发生器进行统一控制。脉冲发生器中有纳微秒脉冲发生模块及切换模块，可以输出不同脉宽的方波脉冲或正弦电压波形。不同波形之间的切换由继电器（JPK43A234，中国 WPVAC）实现，并通过现场可编程门阵列（Field Programmable Gate Array, FPGA）（EP4CE6，中国 ALINX）进行控制。示波器（DPO3024，美国Tektronix）用于显示电流传感器（2100，美国Pearson）和高压探头（PPE5kV，美国LeCroy）采集的电流和电压信号。融合实验所施加的脉冲参数见表2，脉冲施加结束继续培养10min，在细胞悬液中加入20mL碘化丙啶（PI；1mg/mL，美国Life Technologies Corporation）并静置8min，用荧光显微镜（美国Life Technologies Corporation）观察Hoechst 33342以及PI对细胞的染色情况。Hoechst 33342用于细胞核染色，融合实验后通过观察荧光场和明场图像可以判断两个或多个细胞是否融合。PI用于死亡细胞的染色，若细胞被PI染成红色，则认为细胞已经死亡。
图4 细胞融合实验平台
Fig.4 Diagram of cell fusion experiment platform
表2 实验脉冲参数
Tab.2 Experimental pulse parameter
脉冲类型ns电场强度/(kV/cm)ns脉宽/msns个数ms电场强度/(kV/cm)ms脉宽/msms个数总剂量/ (kV2ms/cm2) 第一组ns/ms60.25240136+160 ms2.21401196 第二组ns/ms60.252.540136+250 ms2.67401286 第三组ns/ms60.25340136+360 ms3.14401396
1.2.4 细胞电融合效率统计分析
细胞融合率通常被定义为参与融合的细胞数与细胞总数之比[19, 32]，细胞死亡率为被PI染色的细胞数与细胞总数之比。若参与融合的细胞同时被PI染色，则计入死亡细胞，不计入融合细胞。
所有数据均以四组独立实验的均数±标准差表示，并对不同脉冲组合的实验结果进行显著性检验，用Origin 2019b进行绘制。
在外加脉冲电场的作用下，细胞膜由于电容效应的存在表现出充放电过程，跨膜电压随之发生变化，本节对单msPEF及纳/微秒复合脉冲作用下，双细胞模型跨膜电压分布情况进行分析。图5所示为两种脉冲作用后细胞膜表面跨膜电压沿弧长的分布情况（分析区域见图3）。根据仿真结果可知，单msPEF作用下细胞膜跨膜电压分布（虚线部分）呈“W”型，细胞模型的左右两极及接触区域（黑色点划线范围）的跨膜电压均达到了较高值（＞1V），说明这些区域均存在较大可能被诱导产生显著穿孔。在纳/微秒复合脉冲作用时（实线部分），细胞接触区域产生的跨膜电压略大于msPEF作用，而在细胞两极的跨膜电压则仅为0.3～0.5V，远小于细胞膜的穿孔阈值。
图5 细胞膜跨膜电压分布情况
Fig.5 Distribution of TMV on the cell membrane
当细胞跨膜电压达到穿孔阈值时，会在膜上诱导产生大量的亲水孔，这些孔洞的产生与分布和所施加的脉冲参数密切相关。本节分别选取细胞模型的两个极点以及接触区域的中点（见图3）来研究脉冲作用时膜上孔密度随时间的变化情况，并分析脉冲作用结束后发生显著穿孔（孔密度＞1×1013/m2）的区域[19,32]。
图6为msPEF及纳/微秒复合脉冲分别诱导细胞融合产生的孔密度随时间的变化情况。由图6a可见，msPEF单独作用时，前3ms孔密度并没有发生明显变化，随后B点（见图3）率先出现穿孔，并于7ms左右率先达到了显著穿孔临界点，并最终维持在2.5×1014/m2左右。随着脉冲的持续作用，两级位置的孔密度分别于8ms（A点）和10ms（C点）开始增加，并先后超过了1×1013/m2，但上升趋势较缓，最终稳定的孔密度在1013/m2量级，略小于接触区域孔密度。
纳/微秒复合脉冲作用下的细胞膜穿孔情况如图6b所示。由图可见，在nsPEF作用时间段（前5ms），细胞膜接触区域的孔密度迅速上升，并最终稳定在1.17×1015/m2，在此期间，两极位置的孔密度几乎没有变化。随着msPEF的施加，A点和C点的孔密度开始缓慢增加，增加的速率明显小于单msPEF作用结果，直至脉冲施加结束，两极的孔密度均没有超过1×1013/m2，而B点的孔密度在msPEF作用下一直保持到脉冲作用结束。
图6 细胞膜孔密度随时间变化情况
Fig.6 Cell membrane pore density changes with time
显著穿孔分布如图7所示。为了更加直观地展示细胞膜上显著穿孔的分布，在图7中将膜上孔密度大于1×1013/m2的区域用粗实线标出。由图7a可知，msPEF作用下，细胞膜表面约有10%的膜区域发生了显著穿孔，除了接触区域，细胞的左右两极也发生了大面积的显著穿孔，且靠近正电极的左侧极点区域的显著穿孔面积要大于靠近接地电极的右侧极点区域。而纳/微秒复合脉冲作用下（见图7b），细胞膜显著穿孔都集中在细胞膜接触区域，其余区域并没有发生显著穿孔。
图7 显著穿孔分布
Fig.7 Significant perforation distribution
仿真结果表明，纳/微秒复合脉冲这种脉冲组合方式能有效地将穿孔集中于细胞接触区域并可以在较长时间内有效地维持，而对其余膜区域的影响较小。从理论上分析，该现象有利于降低融合细胞的死亡率，提高细胞的融合效率。
使用已经过Hoechst 33342染料对细胞核进行染色的SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行电融合实验。在进行脉冲处理前需先施加20s的高频正弦电压（100V/cm，1MHz）进行细胞排队，正弦电压作用结束后在较短时间内切换为脉冲电压诱导细胞融合。细胞在电处理结束后继续培养10min，再经过PI染色，即可分别获取经Hoechst和PI染色的细胞明场图像及红色和蓝色的细胞荧光图像。每种脉冲施加方案分别进行四组独立实验，每组实验中随机选取3个视野进行融合细胞、死亡细胞及细胞总量的计数，取平均数计算各组细胞融合率和死亡率。
实验中获得的细胞排队图像及荧光成像结果如图8所示，其中，图8a为细胞排队图像，在交变电压导致的介质电泳效应作用下，细胞沿电场方向排列成珍珠串状。图8b为假处理对照组，该组不进行脉冲处理，其余步骤及培养时间均与实验组相同。图8c和图8d分别为总剂量为286kV2·ms/cm2的msPEF和复合脉冲作用电融合的实验结果。
图8 荧光染色实验成像
Fig.8 Fluorescence staining experiment imaging
图9显示了不同剂量的脉冲作用下，SP2/0小鼠骨髓瘤细胞的融合率和死亡率的统计结果。图9a为两种脉冲施加方式下细胞的融合情况，由图可知，随着施加脉冲剂量的提高，msPEF和纳/微秒复合脉冲作用的SP2/0细胞电融合融合率均呈先上升后下降的趋势，并且二者之间存在着显著性差异。从对照实验组可以看出，没有脉冲作用时细胞的融合效率可以忽略不计；当脉冲的总剂量为196kV2·ms/cm2时，msPEF和复合脉冲的细胞融合率分别为16.79%和23.21%，差别显著（p＜0.05
；当脉冲总剂量增加到286kV2·ms/cm2时，二者的融合率先分别升高到41.51%和74.71%，此时二者差别极为显著（p＜0.001；当脉冲计量继续增加到396kV2·ms/cm2时，二者的融合效率均出现下降，分别为26.87%和47.39%（p＜0.05）。由此可见，纳/微秒复合脉冲的引入确实能在一定程度上提高细胞的融合效率，且脉冲剂量会对融合率产生较大影响。
图9 细胞融合率、死亡率统计结果
Fig.9 Statistical results of cell fusion rate and mortality rate
msPEF和纳/微秒复合脉冲作用细胞电融合时，细胞死亡率的变化情况如图9b所示。由对照组死亡率可知，细胞排队所用的高频正弦电压也会对细胞造成一定伤害，死亡率约为6%；在单msPEF作用时，随着脉冲剂量的上升，细胞死亡率从19.12%上升到了27.83%、53.16%，死亡率增长十分显著；而纳/微秒复合脉冲作用下，随着脉冲剂量的提升，细胞的死亡率分别为13.58%、9.76%、39.35%。由此可见，相较于单个较高幅值的msPEF，高幅值nsPEF结合较低幅值的msPEF这种脉冲施加方式能够显著降低细胞死亡率，并且在一定的脉冲剂量范围内，复合脉冲作用下的细胞死亡率不会随着剂量的增加发生明显变化。
外加脉冲电场会改变细胞膜内外原有的离子分布状态，造成跨膜电压的变化。而跨膜电压的提高会降低膜脂重排所需的能量，从而导致亲水孔的形成[36]。通过分析细胞膜上跨膜电压分布（见图5）可知，持续时间足够短的脉冲（纳秒级别）可以在细胞膜接触区域有选择性地进行大量穿孔，通过计算脉冲作用引起的跨细胞膜的孔密度变化进一步证明了这一点（见图6）。在脉宽40ms的msPEF作用下，细胞膜接触区域的电穿孔同时伴随着细胞两极区域的较大范围穿孔（见图7a），靠近正极板的细胞左极由于静息电位的影响比右极附近区域穿孔更加严重[37]。而在脉冲剂量相同的情况下，先施加5个高幅值nsPEF，再使用低幅值msPEF作用只会导致接触区域发生显著电穿孔，对细胞膜上其他区域则影响较小（见图7b）。过度的细胞电穿孔容易导致细胞死亡，本文的数值仿真结果与实验观察到，单msPEF作用时，SP2/0骨髓瘤细胞的高死亡率相一致。
纳秒脉冲靶向细胞膜接触区域电穿孔可以通过低电导率介质中的膜充电过程进行解释。根据电穿孔基本理论[27]，跨膜电压的时间尺度变化与细胞半径、电场强度及膜充电时间常数相关，在本实验中，细胞半径和电场强度均相同，而膜的充电时间常数则可通过公式
进行计算。由公式可知，时间常数的大小受细胞半径、膜电容大小以及细胞质和细胞外介质电导率的影响。在本文的仿真与实验研究中，选取的细胞外溶液电导率
= 0.01S/m，与细胞质电导率
=0.25S/m相比较小，由于细胞接触区域的两侧均为胞内介质，电导率较大，在相同的电场作用下，充电速度会显著高于膜上剩余区域。通过计算可以得到细胞接触区域和膜上其他区域的细胞膜充电时间常数分别为0.89ms和6ms，均大于本文所选用的nsPEF持续时间，因此不足以产生大面积的穿孔，而接触区域更快的充电速度将导致该区域跨膜电压显著高于膜上其他区域（见图5），nsPEF的靶向作用也得以体现。
有研究表明[24, 38]，细胞膜上的电穿孔数量由施加脉冲的幅值决定，而孔洞的尺寸则更多受脉冲施加时间的影响。在较高幅值的纳秒级别脉冲作用下，孔隙的生成速率会远远大于孔扩张的速率（超穿孔现象），但较短的脉冲持续时间不足以支撑孔的扩张，生成的微孔半径仅为0.8nm左右，且极容易重新封闭。根据电融合基本条件，细胞融合过程的持续时间约为数分钟[39]，在这个过程中需要微孔一直保持“打开”的状态才能保证细胞的成功融合，若通过提高nsPEF的频率和数量来延长孔隙的维持时间，则可能因为nsPEF的高频透膜性诱导其他生物效应的产生而对细胞活性产生影响[40-41]。因此，本文利用msPEF仅靶向作用细胞膜的特点[42]，对已经生成的孔隙进行维持和扩张。低幅值msPEF作用产生的跨膜电压很难达到穿孔阈值，因此不易在其他区域产生大面积穿孔，造成细胞死亡。
本文对SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行了电融合实验，从实验角度验证nsPEF协同msPEF进行细胞电融合的可行性。图9表明，在SP2/0细胞电融合实验中，复合脉冲作用的细胞融合效率普遍大于传统msPEF作用结果，而细胞死亡率则普遍小于msPEF作用结果，该现象证实本文提出的纳/微秒复合脉冲协同作用的细胞电融合效率高于传统微秒脉冲。与msPEF作用相似，随着脉冲剂量的增加，复合脉冲作用下细胞融合效率也经历了先增大后减小的过程，但通过细胞死亡率统计结果可知，复合脉冲作用时，在一定的电场强度范围内细胞死亡率不会随着电场强度的提升而发生显著改变。此现象说明，纳/微秒复合脉冲可以在提高细胞融合效率的同时不增加细胞的死亡率。
若将本文的研究内容扩展到实际应用中，可为脉冲组合的选取提供依据和理论支撑。本实验中所采用的5个脉宽200ns，电场强度6kV/cm的nsPEF结合1个脉宽40ms，电场强度2.5kV/cm的msPEF的复合脉冲组合方式虽然已经超过了传统msPEF的电融合效率，但是并没有考虑到脉冲参数的优化问题，40ms的微秒脉冲也仅为细胞融合仪推荐使用的脉冲参数，并不一定为复合脉冲作用细胞电融合的最优脉冲参数，最优脉冲组合问题仍需后续进一步开展实验进行探究。另一方面，本文仅通过细胞融合率来表征复合脉冲作用细胞电融合的结果，而在实际杂交瘤制备过程中，融合的细胞不一定都能有效存活并发展成为杂交瘤细胞，因此，在后续研究中需要引入杂交瘤培养技术，来探究纳/微秒复合脉冲电融合产生杂交瘤细胞的实际生产效率。
本文从数值仿真和实验分析两个方面，开展了纳/微秒复合脉冲作用细胞电融合融合效率及细胞死亡率的研究，证明了该融合方法提高细胞融合效率、降低细胞死亡率的可行性。
对脉冲作用下细胞跨膜电压分布及穿孔动态过程的仿真研究中，发现纳/微秒复合脉冲具有明显的细胞接触区域靶向穿孔的特性，能够将穿孔集中于细胞接触位置并维持较长时间，而对细胞膜其他区域的影响较小。该研究结果证明，纳/微秒复合脉冲能够结合两种脉冲各自的优势，避免了高幅值微秒脉冲作用下细胞膜过度穿孔情况的出现。通过SP2/0小鼠骨髓瘤细胞的电融合实验研究，证实纳/微秒复合脉冲与微秒脉冲相比，可以降低细胞死亡率，提高细胞融合效率。同时，该融合方法的作用效果同样对脉冲剂量具有一定的依赖性，最优的电融合脉冲组合仍需进一步探索。
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Simulation and Experimental Research on Improving the Efficiency of Cell Electrofusion by Nano-Microsecond Pulsed Electric Fields
Abstract Cell electrofusion technology is usually performed by short-term high-voltage electrical pulses with a duration of microseconds to induce cell electroporation. However, exposure to high amplitude microsecond pulses can easily lead to excessive cell electroporation while promoting cell electrofusion, resulting in the death of the fused cells, thereby limiting the efficiency of cell fusion. To increase the rate of cell electrofusion, this paper proposes a method of synergistic induction of cell electrofusion by combining nanosecond and microsecond pulsed electric fields, based on the phenomenon of “super-electroporation” induced by nanosecond pulsed electric field. In this paper, SP2/0 mouse myeloma cells are used as the experimental object. The COMSOL software is used to analyze the distribution of transmembrane voltage and electroporation density on the cell membrane under the exposure of the composite pulse, and preliminary electrofusion experiments are performed to explore the mortality and fusion rate of the fusion method. The simulation results show that under the traditional microsecond pulse, the transmembrane voltage across the two poles of the membrane and the contact area both exceed the perforation threshold, and the significant perforation area exceeds 10%. Besides, under the action of the same dose of nano/microsecond composite pulse, the transmembrane voltage only reaches a higher value in the cell contact area, and the electroporation is also concentrated in this area. Experimental results also prove that this method can guarantee a lower mortality rate (10%) while achieving a higher cell fusion efficiency (75%), which provides new ideas for the further development of cell electrofusion technology.
keywords：Cell electrofusion, nano-microsecond pulsed electric fields, fusion efficiency, transmembrane voltage, electroporation density
DOI: 10.19595/j.cnki.1000-6753.tces.201315
中图分类号：TM11; TM836; Q64
李成祥 男，1979年生，研究员，博士生导师，研究方向为生物医学中的电工新技术、脉冲强磁场工业应用技术及电力设备在线监测及故障诊断。E-mail: lichengxiang@cqu.edu.cn（通信作者）
李新皓 男，1997年生，硕士研究生，研究方向为生物医学中的电工新技术。E-mail: lixinhao@cqu.edu.cn
收稿日期 2020-09-29
改稿日期 2021-05-20
国家自然科学基金专项基金（81727802）和国家自然科学基金面上（51677017）资助项目。
（编辑 崔文静）